A influência de macrófagos M1, M2 e TAM, e do receptor P2X7 na invasividade e resistência de neuroblastoma / The influence of different macrophages' phenotypes, and of the P2X7 receptor, on the invasiveness and chemoresistance of neuroblastoma

O neuroblastoma é um tumor sólido muito comum em crianças. O estágio mais avançado da doença é altamente agressivo e invasivo, além de pouco responsivo à terapia, que é limitada por mecanismos de resistência e reincidência relacionados à metástase. Muitos estudos tem sido feitos para identificar mecanismos de invasão e quimioresistência de células tumorais, afim de aumentar a sobrevida dos pacientes com câncer. Nesse trabalho, nós estudamos o efeito dos macrófagos, as células imunes mais abundantes no microambiente tumoral, os TAMs (do inglês tumor-associated macrophage) e do receptor P2X7, um purinoreceptor acionado por ATP, nesses processos. Os TAMs respondem e atuam de acordo com a miríade de fatores que encontram, podendo gerar populações heterogêneas e com funções distintas, tanto antitumorais, como pró-tumorais. Altos níveis de ATP extracelular são encontrados no microambiente tumoral, podendo então ativar o receptor P2X7. Este receptor tem sido relacionado tanto a funções inflamatórias como funções na resolução da inflamação de macrófagos. Além disso, o receptor P2X7 está envolvido em uma variedade de eventos celulares, incluindo a secreção de mediadores pró-inflamatórios, a proliferação celular e a apoptose de células tumorais. Primeiramente, foi avaliado o papel do receptor P2X7 na polarização de macrófagos da derivados medula óssea de camundongos wild-type e nocaute para o P2X7 na presença e ausência de fatores secretados por células de neuroblastoma, e então foi estudada a influência desses diferentes macrófagos polarizados em eventos celulares de grande relevância clínica para o neuroblastoma: a invasividade e quimiorresistência. Os resultados demonstraram que, apesar do reconhecido envolvimento do receptor P2X7 na inflamação, a ausência deste receptor não atenua a expressão de marcadores característicos do fenótipo inflamatório, M1. O aumento da expressão do receptor P2Y2, também envolvido na inflamação, nessas células, sugere um mecanismo genético de compensação para não atenuação da inflamação em macrófagos que não expressam o receptor P2X7. Contudo, a ausência do receptor P2X7 levou a alterações no fenótipo alternativo, M2, de modo que a expressão de Tnf, marcador de M2, não foi reprimido. TAMs noucates para P2X7 tiveram a expressão de arg1, marcador de M2, suprimida, reforçando a importância do receptor P2X7 no estabelecimento de fenótipos ativados alternativamente. Nossos dados também sugerem que ausência do receptor P2X7 em TAMs permite a aquisição de um fenótipo capaz de tornar as células de neuroblastoma que expressam P2X7 mais invasivas e mais quimioresistentes à vincristina. Por outro lado, TAMs, independentemente da presença ou ausência do receptor P2X7, induziram a proliferação e quimioresistência das células de neuroblastoma silenciadas para o receptor P2X7, o que nos leva a concluir que o receptor P2X7 em TAMs é desfavorável à progressão de tumores expressando P2X7

Neuroblastoma is a highly common childhood solid tumor. The most advanced stage of the disease is highly aggressive and invasive, besides from being poorly responsive to therapies, which are limited by resistance and recurrence mechanisms related to metastasis. Several studies attempt to identify invasion and resistance mechanisms of the tumor cells in order to increase overall survival of the patients. On the present work, we investigated the effect of macrophages, the most abundant immune cells on the tumor microenvironment, called TAMs (tumor-associated macrophages), and of the P2X7 receptor, an ATP-gated purinoceptor, on these processes. TAMs and cancer cells crosstalk, and behave accordingly to a miriad of factors present at the TME, generating heterogeneous populations with distinct functionalities, either pro- or antitumor. High extracellular levels of ATP are found in the TME, being able to activate the P2X7 receptor. This receptor mediates both pro- and anti-inflammatory functions in macrophages. In addition, it is involved in several cellular events, including the secretion of pro-inflammatory mediators, cell proliferation and tumor cell apoptosis. At first, we evaluated the role of the P2X7 receptor on the polarization of bone marrow-derived macrophages (BMDM), either wild-type or knockout for the P2X7 receptor, in presence or absence or factors secreted by neuroblastoma cells. Next, we investigated the influence of the polarized macrophages in highly relevant cellular events for neuroblastoma, such as invasiveness and chemoresistance. Our results showed that, despite the known involvement of P2X7 receptor on inflammation, its absence did not decrease the expression if inflammatory markers of M1 macrophage populations. An increase in the expression of the P2Y2 receptor, also involved in inflammation, on these cells suggest a genetic compensation mechanism for preventing attenuation of inflammation when P2X7 is lacking. However, P2X7 receptor absence did compromise the M2 phenotype, driving the expression of Tnf. TAMs knockout for the P2X7 receptor were not able to express arg1, also an M2 marker, reinforcing a role of the P2X7 receptor on establishing alternative macrophage phenotypes. Our data also suggest that TAMs lacking the P2X7 receptor acquire a phenotype capable of turning P2X7R-expressing neuroblastoma cells more invasive and chemoresistant to vincristine. On the other hand, TAMs, independently on the presence of the P2X7 receptor, induced proliferation and resistance of neuroblastoma cells silenced for P2X7 receptor expression, leading us to the conclusion that the P2X7 receptor in TAMs is unfavorable for the progression of P2X7R-expressing tumors

Pró-Fármacos dendriméricos potencialmente ativos em Malária e Tuberculose: Síntese e avaliação da atividade biológica / Dendrimeric prodrugs potentially active in malaria and tuberculosis: Synthesis and evaluation of biological activity

HIV/AIDS, tuberculose, malária e as doenças tropicais negligenciadas representam uma grande preocupação em Saúde em muitas regiões do mundo. Os fármacos disponíveis para o tratamento apresentam diversos problemas, tais como toxicidade e resistência ao parasita. Mesmo com esse triste panorama, o investimento em pesquisa nessa área é, ainda, pouco significativo. Assim, dentre os métodos de modificação molecular para melhorar propriedades farmacêuticas, farmacocinéticas e/ou farmacodinâmica de compostos bioativos destaca-se a latenciação. Já os dendrímeros vêm despertando interesse em aplicações biológicas, principalmente como transportadores de fármacos, além de atuarem como transportadores de genes, imagem em diagnóstico e compostos com ação per se. Face ao exposto e tendo em vista o caráter promissor dos dendrímeros como sistemas de drug delivery, o objetivo deste trabalho foi a síntese de pró-fármacos dendriméricos potencialmente ativos em malária e tuberculose. Os dendrímeros de Bis-MPA (gerações 0, 1 e 2) foram sintetizados pelo grupo do Professor Scott Grayson, da Tulane University (EUA). No Brasil, foram feitas as funcionalizações destes compostos, através do acoplamento do ácido succínico (que funciona como espaçante) e as moléculas ativas. Selecionaram-se as seguintes substâncias: (1) primaquina, com ação antimalárica e (2) isoniazida, de ação nos primeiros estágios da tuberculose. Foram sintetizados os pró-fármacos dendriméricos de isoniazida nas gerações 0 e 1 (G0-Iso e G1-Iso), e primaquina nas gerações 0, 1 e 2 (G0-Pq, G1-Pq e G2Pq). Importante mencionar que os resultados de Ressonância Magnética e Nuclear de 1H e de 13C demostraram as obtenções dos respectivos produtos, porém contendo impurezas. Já a análise do resultado proveniente da espectrometria de massas do composto G0-Iso revelou a presença de um subproduto ciclizado da isonizaida succinoilada (CIso-Suc), o qual pode ser um potencial pró-fármaco ou apresentar atividade per se. Como não se conhece este composto, o laboratório coordenado pela Profas Elizabeth Igne Ferreira e Jeanine Giarolla manifestou interesse em pesquisa-lo, principalmente quanto suas propriedades físico- químicas, bem como quanto à atividade biológica. Assim, utilizando metodologia analítica previamente estabelecida para o G0-Iso, os estudos de estabilidade química da CIso-Suc, em diferentes valores de pH, demonstraram a capacidade da forma ciclizada em se converter no protótipo Iso-Suc, majoritariamente em pH 7,4 e 8,5. Como perspectivas, destaca-se a avaliação da estabilidade enzimática deste potencial derivado. Ressalta-se, ainda, a a avaliação da respectiva atividade antimicobacteriana. Em relação aos pró-fármacos, as necessidades de aprimoramentos das sínteses são, também, evidenciadas. Uma vez sintetizados e caracterizados, estes últimos derivados serão avaliados quanto à atividade biológica. Ademais, estudos computacionais, sobretudo simulações de docking molecular, foram desenvolvidos com intuito de se entender o modo de interação de alguns compostos com alvos biológicos pré-determinados

HIV/AIDS, tuberculosis, malaria and neglected diseases are a major health concern in many regions of the world. The drugs available present various problems, such as toxicity and parasite resistance. Even with this sad outlook, research investment in this area is still insignificant. Among the molecular modification methods to improve the pharmaceutical, pharmacokinetic and/or pharmacodynamic properties we stands out prodrug design. On the other hand, dendrimers are arousing interest in biological applications, mainly as drug carriers, besides gene delivery, diagnostic imaging, as well as acting as compounds with activity per se. Considering that, added to the promising dendrimer drug delivery features, the aim of this study was to synthesize potentially active dendrimer prodrugs in malaria and tuberculosis. Bis-MPA dendrimers (generations 0, 1 and 2) were synthesized by the group of Professor Scott Grayson of Tulane University (USA). Herein in Brazil, the compounds were functionalized by coupling succinic acid (spacer group), as well as the active molecules. We selected the following substances: (1) primaquine, with antimalarial action and (2) isoniazid, acting in the early stages of tuberculosis. Isoniazid dendrimer prodrugs were synthesized generations 0 and 1 (G0-Iso and G1-Iso), and primaquine in generations 0, 1 and 2 (G0-Pq, G1-Pq and G2-Pq). It is important to mention that the results related to Nuclear and Magnetic Resonance 113C showed chemical structures features, however with impurities. Analysis of the mass spectrometry regarding G0-Iso has revealed the presence of a cyclized by-product of succinylated isonized (CIso-Suc), which may be a potential prodrug or may presentactivity itself. Using the analytical methodology performed for G0-Iso, ICso-Suc demonstrated its ability to convert the Iso-Suc prototype at different pH values, especially at pH 7.4 and 8.5. As perspectives, we highlight the determinations of the chemical stability of ICsoSuc at pH 1.5 and 6.0, as well as the evaluation of the enzymatic stability. We will also investigate the respective antimicobacterial activities. Regarding prodrugs, the needs for synthesis enhancements are also necessary. Once synthesized and characterized, these latter derivatives will be evaluated for biological activity. Moreover, computational studies, especially molecular docking simulations, were developed in order to understand the mode of interaction of some compounds with predetermined biological targets